菌類ウイルスの機能解析とウイルス由来新規抗菌性タンパク質の応用研究
メンバー： 森山裕充
分野： 境界農学、生物科学、生産環境農学
所属： 農学研究院 生物制御科学部門
キーワード： 応用菌類ウイルス学、細胞分子生物学、マイコウイルス、2本鎖RNAウイルス、微生物学、酵母分子遺伝学、イネ遺伝育種
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研究概要
菌類や植物では、潜在的に感染する2本鎖RNA(dsRNA)ウイルスが知られており、一方、菌類では遺伝子として機能するプリオンタンパク質も存在する。これらは、染色体の遺伝子とは独立した表現型を現すため、非メンデル遺伝因子と称される{1}。菌類ウイルスは、糸状菌、酵母菌、栽培キノコなどから広く検出されており、dsRNAをゲノムとするものが7科、プラス鎖RNAウイルスが5科、マイナス鎖RNAウイルスとしては1科が国際ウイルス分類委員会により定義されている{2}。このうち、酵母Saccharomyces cerevisiaeのキラー因子の担い手となるL-Aウイルス(dsRNAゲノム)は、Totiviridaeに属し、本ウイルス科の典型種として位置付けられている。一般に、菌類ウイルスは（以下、マイコウイルス）細胞外感染経路を持たず、細胞または菌糸融合により感染することを特徴とする。
これまでに植物病原糸状菌であるアルターナリア・アルタナータ菌やイネいもち病菌などからは宿主菌の生育を阻害する新種のdsRNAウイルスが見出されてきたが、これらのマイコウイルス遺伝子配列は新規であり既知情報による機能の推測が困難であった。そこで私達はパン酵母異種遺伝子発現系を利用して、植物病原菌に感染する各種マイコウイルス由来のタンパク質を発現する酵母細胞の生育試験を行うことにより、宿主病原菌の生育阻害に関与するウイルス由来タンパク質を同定する手法を確立してきた{3}。次に、本手法で同定された新規な抗菌性タンパク質を、ヒト病原性酵母のクリプトコックス(Cryptococcus neoformans)細胞内で発現させる系を確立して、宿主菌の生育に関する影響調査を行った。その結果、イネいもち病菌マイコウイルス由来のORF4タンパク質を強制発現させたクリプトコックスは、生育速度の低下、異常な液胞の細胞内蓄積、莢膜多糖の形成阻害などが観察され、宿主菌の病原力を低下させ得ることが示唆された{4}。本評価方法は、糸状菌と酵母の両方の菌細胞に対して生育阻害活性を有するマイコウイルス由来抗菌性タンパク質のスクリーニングに有効であることが示された。またピキア酵母異種発現系を利用することで、生育阻害活性を有するマイコウイルスタンパク質は産生可能であることも確認された。
主要論文・参考事項
【原著論文】（査読有り）
1) Urayama S, Katoh Y, Fukuhara T, Arie T, Moriyama H(責任著者), Teraoka T Rapid detection of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-A from fungal colonies on agar plates and lesions of rice blast. Journal of General Plant Pathology (2014)（印刷中）
2) Okada R, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T, Natsuaki T. A simple and rapid method for viral dsRNA isolation from plant and fungal tissue. Journal of General Plant Pathology (2014)（印刷中）
3) Yoshii A, Omatsu T, Katayama Y, Koyama S, Mizutani T, Moriyama H, Fukuhara T. Two types of genetic carrier, the IncP genomic island and the novel IncP-1β plasmid, for the aac(2′)-IIa gene that confers kasugamycin resistance in Acidovorax avenae ssp. avenae Molecular Plant Pthology (2014)（印刷中）
4) Urayama S, Sakoda H, Takai R, Katoh Y, Le TM, Fukuhara T, Arie T, Teraoka T, Moriyama H(責任著者). A dsRNA mycovirus, Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-B, suppresses vegetative growth and development of the rice blast fungus. Virology 448: 265-273 (2014).
5) Urayama S, Fukuhara T, Moriyama H(責任著者), Toh-e A, Kawamoto S. Heterologous expression of a gene of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A disrupts growth of the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbiology and Immunology 58: 294-302 (2014)
6) Okada R, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T, Valverde RA(共責任著者). A new endornavirus species infecting Malabar spinach (Basella alba L.). Archives of Virology 159: 807-809 (2014)
7) Nagano H, Fukudome A, Hiraguri A, Moriyama H, Fukuhara, T. Distinct substrate specificities of Arabidopsis DCL3 and DCL4. Nucleic Acids Research 42(3): 1845-1856 (2014)
8) Murata T, Sato T, Kamoda T, Moriyama H, Kumazawa Y, Hanada N Differential susceptibility to hydrogen sulfide-induced apoptosis between PHLDA1-overexpressing oral cancer cell lines and oral keratinocytes: Role of PHLDA1 as an apoptosis suppressor. Experimental Cell Research 320: 247-257 (2014)
【総 説】（査読無し）
9) イネいもち病菌の病原力（性）と菌類ウイルスの作用とその応用 浦山俊一・Le Minh Tuong・岡田亮・加藤優・福原敏行・有江力・森山裕充・寺岡徹 土と微生物 68巻1号 p3-5 (2014)
10) Nishide Y, Watanabe K, Inoue H, Moriyama H, Satoh T, Hinomoto N, Iwabuchi K. Isolation of novel microsatellite markers for the social parasitoid wasp, Copidosoma floridanum. Applied Entomology and Zoology 48: 93-96 (2013)
11) Okada R, Yong CK, Valverde RA, Sabanadzovic S, Aoki N, Hotate S, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T. Molecular characterization of two evolutionally distinct endornaviruses co-infectiong common bean (Phaseolus vulgaris). Journal of General Virology 94(1): 220-229. (2013)
【総 説】（査読無し）
1) イネいもち病菌のマイコウイルスを用いた防除資材の開発 浦山俊一、森山裕充 JATAFFジャーナル No.12 Vol.11 p19-23 (2013)
特許】
1) PCT/JP2013/083783 抗真菌剤 出願人 国立大学法人東京農工大学 発明者 浦山俊一 森山裕充
2) 特願2013-034881 抗真菌剤 出願人 東京農工大学 発明者 浦山俊一 森山裕充
【その他】
【招待講演】
1】菌類ウイルスの探索・解析と応用に向けた研究 森山裕充 昆虫病理研究会シンポジウム 主催者：昆虫病理研究会 2014年9月19日 人材開発センター富士研修所
お問い合わせ先
東京農工大学・先端産学連携研究推進センター
urac[at]ml.tuat.ac.jp（[at]を@に変換してください）
Research and Development of mycovirus attenuating plant pathogenic fungi as biocontrol agents
Research members： Hiromistu Moriyama PhD.
Research fields： Boundary agriculture, Biological Science, Plant production and environmental agriculture
Departments： Division of Agriscience and Bioscience, Institute of Agriculture
Keywords： Applied fungal virology, Molecular and Cell Biology, Mycovirus, double-stranded RNA, Microbiology, Yeast Genetics, Rice Breeding
Web site：
Summary
Hundreds of antifungal proteins and peptides produced by plants, bacteria, insects, mollusks, fungi, and mammals have been reported, with more being discovered. Several antifungal proteins and peptides are being tested for use as pharmaceutical agents for the treatment of human and animal fungal diseases (Selitrennikoff, 2001). The killer phenomenon in yeasts was discovered in Saccharomyces cerevisiae, and is widely distributed in other yeast genera. K1 protein, encoded by satellite M1-dsRNA, is one of the best-known killer toxins which disrupt the electrochemical ion gradient across the plasma membrane. Killer yeast is applicable for fermentation as starter culture to reduce contamination.
Fungal viruses, known as mycovirus, had been found in almost all genera of Fungi. In some cases, mycovirus infection resulted in the phenotypic changes of host fungi including plant pathogenic fungi such as Cryphonectria parasitica, Rosellinia necatrix, Alternaria alternate. Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A (MoCV1-A) is the first mycovirus that causes impaired growth and abnormal pigmentation of the host rice blast fungus, Magnaporthe oryzae (Urayama et al., 2010). MoCV1-A, which is tentatively classified as a member of the Chrysoviridae, has five dsRNA segments, and each dsRNA encodes a single ORF (ORF1 to ORF5). In previous study, aggregated hyphae of M. oryzae were observed by the addition of purified MoCV1-A particles to liquid culture. Expression of the MoCV1-A ORF4 protein (ORF4p), which is one of the structural proteins, in S. cerevisiae resulted in growth defects, suggesting that ORF4 is one of the causal agents of damage to the host cell. Furthermore, expression of the MoCV1-A ORF4p in human-pathogenic C. neoformans also caused growth defects.
Reference articles and patents
【原著論文】（査読有り）
1) Urayama S, Katoh Y, Fukuhara T, Arie T, Moriyama H(責任著者), Teraoka T Rapid detection of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-A from fungal colonies on agar plates and lesions of rice blast. Journal of General Plant Pathology (2014)（印刷中）
2) Okada R, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T, Natsuaki T. A simple and rapid method for viral dsRNA isolation from plant and fungal tissue. Journal of General Plant Pathology (2014)（印刷中）
3) Yoshii A, Omatsu T, Katayama Y, Koyama S, Mizutani T, Moriyama H, Fukuhara T. Two types of genetic carrier, the IncP genomic island and the novel IncP-1β plasmid, for the aac(2′)-IIa gene that confers kasugamycin resistance in Acidovorax avenae ssp. avenae Molecular Plant Pthology (2014)（印刷中）
4) Urayama S, Sakoda H, Takai R, Katoh Y, Le TM, Fukuhara T, Arie T, Teraoka T, Moriyama H(責任著者). A dsRNA mycovirus, Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-B, suppresses vegetative growth and development of the rice blast fungus. Virology 448: 265-273 (2014).
5) Urayama S, Fukuhara T, Moriyama H(責任著者), Toh-e A, Kawamoto S. Heterologous expression of a gene of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A disrupts growth of the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbiology and Immunology 58: 294-302 (2014)
6) Okada R, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T, Valverde RA(共責任著者). A new endornavirus species infecting Malabar spinach (Basella alba L.). Archives of Virology 159: 807-809 (2014)
7) Nagano H, Fukudome A, Hiraguri A, Moriyama H, Fukuhara, T. Distinct substrate specificities of Arabidopsis DCL3 and DCL4. Nucleic Acids Research 42(3): 1845-1856 (2014)
8) Murata T, Sato T, Kamoda T, Moriyama H, Kumazawa Y, Hanada N Differential susceptibility to hydrogen sulfide-induced apoptosis between PHLDA1-overexpressing oral cancer cell lines and oral keratinocytes: Role of PHLDA1 as an apoptosis suppressor. Experimental Cell Research 320: 247-257 (2014)
【総 説】（査読無し）
9) イネいもち病菌の病原力（性）と菌類ウイルスの作用とその応用 浦山俊一・Le Minh Tuong・岡田亮・加藤優・福原敏行・有江力・森山裕充・寺岡徹 土と微生物 68巻1号 p3-5 (2014)
10) Nishide Y, Watanabe K, Inoue H, Moriyama H, Satoh T, Hinomoto N, Iwabuchi K. Isolation of novel microsatellite markers for the social parasitoid wasp, Copidosoma floridanum. Applied Entomology and Zoology 48: 93-96 (2013)
11) Okada R, Yong CK, Valverde RA, Sabanadzovic S, Aoki N, Hotate S, Kiyota E, Moriyama H(責任著者), Fukuhara T. Molecular characterization of two evolutionally distinct endornaviruses co-infectiong common bean (Phaseolus vulgaris). Journal of General Virology 94(1): 220-229. (2013)
【総 説】（査読無し）
1) イネいもち病菌のマイコウイルスを用いた防除資材の開発 浦山俊一、森山裕充 JATAFFジャーナル No.12 Vol.11 p19-23 (2013)
特許】
1) PCT/JP2013/083783 抗真菌剤 出願人 国立大学法人東京農工大学 発明者 浦山俊一 森山裕充
2) 特願2013-034881 抗真菌剤 出願人 東京農工大学 発明者 浦山俊一 森山裕充
【その他】
【招待講演】
1】菌類ウイルスの探索・解析と応用に向けた研究 森山裕充 昆虫病理研究会シンポジウム 主催者：昆虫病理研究会 2014年9月19日 人材開発センター富士研修所
Contact
University Research Administration Center(URAC),
Tokyo University of Agriculture andTechnology
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